Western Blot General Protocol

跑样的主要溶液和试剂；转移和封闭

跑样缓冲液10X:

三羟甲基氨基甲烷: 250 mM

甘氨酸: 1.90 M

十二烷基硫酸钠: 1%.

缓冲液的pH值应为8.3，无需调节pH值。在室温下储存跑样

缓冲液，并在使用前稀释。

跑样缓冲液1X:

10% 10X 跑样缓冲液

90% DW H2O

三甘氨酸缓冲液 1X:

25 mM 三羟甲基氨基甲烷

190 mM 甘氨酸

转印缓冲液:

20% MetOH

0.25X 三甘氨酸缓冲液

磷酸盐缓冲盐水（PBS）1X:

137 mM NaCl

2.7 mM KCl

10 mM Na2HPO4

1.8 mM KH2PO4

PBS Tween (PBST) 1X:

0.05% Tween

99.95% PBS 1X

封闭缓冲液:

5% 脱脂牛奶（或牛血清白蛋白-BSA）

95% PBST

流程

电泳-蛋白质分离

1. 制备合适的SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）进行电泳。

SDS-PAGE凝胶的类型取决于蛋白质的大小；蛋白质越小，应使用浓度越高的凝胶。

2. 制备样品，装入SDS-PAGE凝胶孔中。

样品和样品缓冲液的制备取决于蛋白质的类型和制造商的建议。

3. 将蛋白质标记物和等体积的蛋白质样品装入SDS-PAGE凝胶的相应孔中。

用样品缓冲液装入空的孔中。

4. 向电泳槽中加入缓冲液。

5. 在以下条件下运行凝胶:

a. 120 V，持续20-30分钟（或直到样品达到堆积凝胶);

b. 180 V持续30-45分钟（在恒定电压下分离蛋白质）。

蛋白质电转移

1. 如果是PVDF膜，通过以下方式进行膜平衡:

a. 将膜浸入甲醇中1分钟;

b. 之后将膜浸入DW水中5分钟;

c. 然后将膜浸入转移缓冲液中10分钟.

膜必须始终保持湿润.

2. 按照图1所示的方案组装转移夹层。

确保凝胶和膜之间没有气泡。

3. 将盒子放入转移罐中，并把转移缓冲液装入电吸罐（确保

夹层被缓冲液覆盖）。

4. 在冰盒中以120 V的电压运行电印迹1小时。

运行条件可能需要优化。

阻断和抗体培养

1. 在室温下将膜在封闭缓冲液中培养1h，或在4°C下持续震动过夜。

膜的活性面必须始终与溶液接触。

2. 将印迹置于一抗溶液中，在室温下搅拌培养1小时。

溶液应在膜的表面自由移动（抗体的稀释取决于生产商的建议）。

3. 清洗转印膜:

a. 晃动着浸泡在PBS-Tween(PBST)中10分钟;

b. 晃动着浸泡在PBS-Tween(PBST)中5分钟（清洗两次）.

4. 将印迹置于二抗溶液（HRP缀合物）中，并在室温下晃动培养45分钟。

抗体的稀释取决于生产商的建议。

5. 根据封闭和抗体培养部分第3点中描述的清洗步骤清洗转印膜。

化学发光检测

1. 制备1:1的化学发光基质混合物（ECLHRP，根据灵敏度选择光波；光波加或光波最大值）。

2. 将印迹放入带有基质的容器中，并孵育3分钟。

3. 除去膜上多余的溶液。

4. 将薄膜放入“印迹显影”文件夹中，用滚轴轻轻地抹去所有气泡。

5. 将胶片曝光到成像系统。

0.45 µm PVDF 转印膜

按照Western印迹标准方案获得图像

细胞通道：HeLa全细胞检测基板：光波Plus

一抗：β-肌动蛋白多克隆抗体（稀释度1:1000）

二抗：山羊抗兔IgG抗体（H+L）（稀释度1:10000）

分析蛋白质：β肌动蛋白，分子量：42 kDakDa